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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 來源:Lucas? CancerEvolution ? ? ?? 發布時間：2019-7-6

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背景

著名進化生物學家Stephen Jay Gould在21世紀初曾提出一個問題，如果我們能夠把生命像磁帶一樣倒轉到最開始的起點，再次進化，我們是否還會得到相同的結果[1]? 盡管逆轉生命目前仍是一個猜想，但是癌癥的發生發展正像磁帶一樣每天進行播放或者重復播放，僅2012年在全球就有1400萬新發病例和820萬人患癌死亡，且這個數目預計在接下來的二十年內將會增長70%[2]。癌癥之所以有如此高致死率和低治愈率及其普遍存在的抗藥性，主要問題在于癌癥的異質性。癌癥進化過程中復雜多變的遺傳和表觀修飾突變給其進化發展方向帶來多種可能性，同時也正是由于這些突變資源，隨著高通量測序技術的發展，我們可以通過測序來獲取這些突變信息，來解碼癌癥的進化磁帶，推斷這些基因組變異在進化磁帶上的發生順序，挖掘癌癥進化過程中的關鍵事件，從而給癌癥的延緩甚至治愈提供方向。

縱觀目前已進行多區域測序的癌癥研究項目，不同癌癥類型的不同病人在腫瘤轉移或復發時出現的亞克隆編碼突變數目在0～8000范圍內高度變化（圖1）[3]。盡管在取樣過程中、癌癥分級、測序深度方面存在差異，但是可以明顯地看到在一些特定的癌癥類型中，如黑色素瘤、肺癌，主克隆突變數顯著高于其他癌癥類型，這可能是由于此類癌癥發生發展容易受到外界環境因素如紫外線照射和尼古丁類致癌物的影響（圖1）。同時高豐度的主克隆突變并不意味著高豐度的亞克隆突變，如初級神經腦膠質瘤擁有最高豐度亞克隆突變，但是其主克隆突變數卻較低，表明癌癥進化過程中存在多樣的突變機制，對于這類腫瘤，高豐度亞克隆突變可能是跟錯配修復缺陷有關[4-5]，而在非小細胞肺癌和膀胱癌中卻可能是由于APOBEC家族導致[6-8]。所以，在一些特定腫瘤里，主克隆突變反應了在腫瘤發生前的進化情況，亞克隆突變則更多地是癌癥發生后的進化情況，在腫瘤治療過程中，我們應該綜合考慮兩者情況。

圖1 不同癌癥類型非沉默突變的異質性程度分布

癌癥進化過程中關鍵突變發生的不同順序有時會導致截然不同的癌癥發展方向。在骨髓增殖類腫瘤中，先發生TET2突變將會導致造血干細胞等祖細胞擴張，而紅系祖細胞的增值會受到抑制直到出現JAK2突變；相反，若是JAK2突變發生在前，紅系祖細胞將會出現增值擴張而造血干細胞則會受到抑制。在臨床層面，JAK2突變在前的病人往往相比于先發生TET2突變的病人更可能出現紅細胞增多癥也更可能造成血栓（圖2）。對于兩者不同進化模式的治療方法也會有不同的側重點，因為針對早期的突變進行靶向治療，在一定程度上影響的是所有的癌癥細胞，所以ruxolitinib作為JAK2抑制劑在JAK2早期突變病人身上則會相對取得最佳治療效果[9]。

圖2 JAK2和TET不同突變順序對骨髓增殖類腫瘤的影響

?目前，大約有16種癌癥類型通過多區域取樣測序構建了對應的突變順序進化圖(表1)。以腎癌進化為例，往往是最早期發生了3p的雜合丟失和VHL突變，隨后同樣在3p的位置上再次出現了SETD2，BAP1等基因突變。癌癥進化過程中除了編碼突變還會存在甲基化修飾，拷貝數變化，結構變異等一系列突變，這些突變有時出現在癌癥進化的不同階段分別扮演不同的角色，同時這些突變之間也會存在協同或是相互影響，比如在非小細胞肺癌中，早期染色體不穩定性會在一定程度上影響后期突變的異質性程度，也會顯著提高癌癥復發死亡的風險[10]。

表1 16種癌癥類型的早期和晚期克隆突變

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研究手段

1. 抗藥性或著復發的腫瘤患者。藥物治療前后，復發前后，至少2次取樣。

2. 多個轉移灶的腫瘤患者。對于多個轉移區域進行取樣。

3. 接受免疫藥物治療的腫瘤患者。免疫應答與不應答患者分組。

4. 以上均進行WES 測序，視前期結果和研究目的而定是否進行RNA測序，ctDNA，TCR 測序，CRISPR-Cas9 細胞系實驗驗證。

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研究方法

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研究案例

1. 白血病復發前后取樣揭示白血病進化歷史和關鍵突變(【文章解讀】時間維度多點取樣揭示腫瘤進化復發的關鍵突變,?Catherine J Wu et al, 2015, Nature)[11].

   

   多點時間維度的取樣測序可以揭示腫瘤的進化歷史，研究不同治療手段下抗藥性的根源，啟發下一步的治療靶標。

2. 多區域測序揭示非小細胞肺癌進化歷史(,?Charles Swanton et al, 2017, NEJM)[10]

多區域取樣測序同樣也可以研究腫瘤的異質性和進化歷史，定位主克隆和亞克隆突變，在臨床治療和藥物開發方面更有針對性。?

3.ctDNA監控非小細胞肺癌克隆結構動態變化(,?Charles Swanton et al, 2017, Nature)[12]

通過ctDNA的方法對已構建的腫瘤進化結構進行監控，對藥物治療和手術治療的療效進行評估，對腫瘤的抗藥性和復發進行預測。

挖掘能夠引起腫瘤免疫活性的抗原突變，尤其是相關的主克隆突變抗原，這將給接下來的免疫治療提供精準的方向。

5.解密免疫微環境異質性(,?Martin L. Miller et al, 2017, Cell)[14]

腫瘤免疫是一個腫瘤細胞和微環境相互作用的復雜過程，微環境也會存在免疫異質性，揭露它們之間的相互關系，在免疫細胞層面發掘出能夠引起特定T細胞抗原受體擴張的突變抗原，能夠進一步佐證突變靶標的正確性，給腫瘤免疫藥物的開發，如腫瘤免疫疫苗，小分子化合物，T細胞的體外改造和回輸，提供精準的方向和理論指導。

6.研究腫瘤免疫逃逸和免疫不應答機制(,?Van Allen et al, 2018 & Shirley Liu et al, 2018 Science）[15-16]

免疫應答與不應答患者分組，常規基因組分析得到差異基因組變化，分析轉錄組數據，驗證是否影響到了免疫相關通路，最后利用crispr cas9 構建目標差異的野生型和突變型細胞系，實驗驗證免疫細胞的活性。

PBRM1基因在之前的腎癌基因組研究中突變率接近40%，而其所在的染色體變化如3p丟失占到了90%以上，幾乎覆蓋了透明細胞腎癌病人。該研究把PBRM1的功能性丟失與免疫應答建立了關聯，這對相關腎癌病人的腫瘤免疫用藥起到了臨床指導作用。同時，同期的哈佛大學劉小樂教授團隊也報道了PBRM1編碼蛋白質的PBAF復合物功能性丟失，增多了作用于IFNy相關基因的啟動子和增強子區域轉錄因子的染色質位點，從而提升了腫瘤細胞對IFNy的敏感性，最后提高了患者的免疫應答水平。由此可見，在基因組研究早期，我們對于PBRM1等顯著突變的認知只存在于其會促進腫瘤的發生發展，而隨著腫瘤免疫療法的興起，其在腫瘤治療方面還會存在積極作用，這提示我們，對于以往的基因組變化，我們以前看負面的事件，可能還會存在積極的一面，正所謂陰陽相生，希望在此基礎上，對腫瘤免疫尤其是抵抗機制有更深入全面的研究，造福廣大腫瘤患者。

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討論

癌癥進化是一個復雜多變的命題，癌細胞會根據周圍的微環境，隨著其改變而不斷適應進化。它既具有偶然性，因為它的突變方向不可預知，同時它又有收斂性，縱使它千變萬化，最終突變造成的功能紊亂卻總是發生在類似的生物學通路上。可以確定，我們可以通過對治療前和治療后的病人多次取樣，或者不同轉移灶進行多區域取樣，針對不斷變化的癌癥，解碼其進化路線和關鍵突變，在早期即針對性進行預防或抑制，同時以此為基礎設計panel，對于未來潛在的變化如抗藥性，療效評估，手術效果評估等，我們能通過ctDNA等液體活檢技術實時監測其發展，最后結合腫瘤新抗原預測，免疫組庫測序，CRISPR-Cas9實驗驗證，把腫瘤基因組層面發現應用于腫瘤的臨床治療，真正實現腫瘤的個體化藥物開發和精準治療。